Orvosi Hetilap, 1998. december (139. évfolyam, 49-52. szám)
1998-12-06 / 49. szám - Pajor László: Az interfázis citogenetika alkalmazási lehetőségei az onkopatológiai diagnosztikában
jén, immunhisztológiai módszerrel vizsgálni. A transzkripció, valamint a transzláció külön-külön vagy szimultán történő vizsgálatára csak nagyon speciális, általában experimentális körülmények között van igény. Celluláris DNS szekvenciák citológiai-hisztológiai körülmények között történő feltüntetése azonban csak IPC-vel lehetséges. Bár elsőként 1969-ben, egymástól függetlenül, Purdue és Gall, valamint John és munkatársai számoltak be génszekvenciáknak (rDNS) interfázis magokon ISH-val történő sikeres kimutatásáról, a módszert csak 1986-tól, Cremer nyomán nevezik interfázis citogenetikának (17, 25,42). A történelminek tekinthető közlésben a szerzők az IPC napjainkig is érvényes egyik legproblematikusabb sajátosságát is világosan megfogalmazták: „... the major technical problems in the hybridization technique is that of denaturing the cellular DNA without destroying the morphology” (42). A kezdeti időkben a hibridizációs termék előhívására csak a radioizotópos jelölés állt rendelkezésre, mely ugyan nagy érzékenységet, de alacsony térbeli feloldást biztosított. Ez az oka, hogy több mint egy évtized kellett ahhoz, hogy a módszer orvosbiológiaidiagnosztikai alkalmazása igazi lendületet kapjon. A lökést a hibridtermék fluoreszcens jelölésének kidolgozása adta meg. Ez kezdetben a kémiailag módosított nukleotidok direkt fluoreszcens jelölését jelentette (1980), majd a polinukleotidok biotin jelölésének kidolgozásával (1981) a vizualizálás spektruma valóban szélessé vált (7, 31). 1986-ra a kimutathatóság alsó határa 50 kilobázisra (kb) csökkent (43), majd elsősorban az anyagfeltárási technikák fejlődésének eredményeképpen sor került a módszer rutin paraffinos anyagokon történő alkalmazásának bevezetésére is (20). A 90-es években nem sikerült a fenti érzékenységet hagyományos mikroszkópia segítségével meghaladni, viszont a nagy érzékenységű kamerák (digitális mikroszkópia) alkalmazásának bevezetésével a szenzitivitás, a néhány száz kb-ra tehető feloldás mellett, 15 kb-ra csökkent (4, 57). A legújabb idők kihívását a genomban egy kópiában előforduló szekvenciákban kialakuló pontmutációk IPC-vel történő detektálása jelenti. Az utóbbiak azonban részben experimentális körülményeket jelentenek, illetve fejlesztés alatt álló területek. A patológiai diagnosztika jelentős alkalmazási területre talált az 50-100 kb érzékenységi nagyságrend szintjén is, melynek szemelvényei az alábbiak. Számbeli kromoszómaeltérések vizsgálata IPC-vel A magasabb rendű eukaryoták genomjának 10-20%-át, sajátos bázisösszetételének betudhatóan a genom fő tömegét adó DNS-től denzitása alapján elkülönülő, azt „kísérő”, szatellita DNS (sDNS) alkotja (16). Az sDNS különböző osztályainak közös vonása, hogy rövidebbhosszabb alapegységeik (monomer) ezerszer-milliószor ismétlődnek a genomban, ezért tandem (repeat) szekvenciáknak nevezik őket. A humán sDNS egyik formája az alfa-szatellita DNS (a-sDNS), mely a kromoszómák (peri)centromerikus régiójára lokalizálódó, nem a-sDNS-től mentes, a teljes genom mintegy 25%-át kitevő repetitív DNS (15). Az a-sDNS alapegységét az elsőként az afrikai zöld majmok genomjában megtalált, 172 bp alfoid monomerhez szekvenciájában és organizációjában is nagyon hasonló 171 bp hosszú monomer alkotja (60) (1. ábra). Leglényegesebb vonása a speciális, magasabb rendű hierarchikus rendezettség, melynek lényege a következő. A 171 bp monomerek lineáris multimereket hoznak létre, melyekben az intermonomer DNS szekvencia divergencia eléri a 20-40%-ot is, így az 1. ábrán bemutatott, egy kromoszómán elhelyezkedő monomer 1, 2 és 3 olyan mértékben különbözik egymástól, mint a más kromoszómákon elhelyezkedő asDNS monomerektől. Azonban egy jellegzetes számú (n) monomert követő monomer (n + 1) újra a monomer 1- gyel lesz gyakorlatilag (12% divergencia) identikus. Az n hosszúságú lineáris multimert magasabb rendű repetitív szekvenciának (higher order repeat unit, HORU) nevezik. Több mint 30 pc-sDNS alcsaládot írtak le (13), melyből 28-nak, összesen 293 személy genomjának vizsgálata alapján, a konszenzus szekvenciáját is megállapították. Az a-sDNS alcsaládok különböznek a HORU-k nagyságában (monomerek száma), a HORU-k kópiaszámában és értelemszerűen a primer szekvenciájukban. Ezekből következik kromoszómaspecificitásuk, mely azonban nem teljes körű. Az 5-ös vs. 19-es,a 13-as vs. 21- es, valamint a 14-es vs. 22-es kromoszómák vonatkozásában nincs olyan HORU, amelyek ne mutatnának jelentős átfedést, így kereszthibridizációt. (Valójában ez a 14- es és 22-es kromoszóma esetében nem áll, mivel mindkettőre találtak specifikus a-sDNS alcsaládot, de ezek a bennük előforduló HORU-k alacsony kópiaszáma miatt nem vizualizálhatók [13]). Kromoszómaspecifikus próbákkal történő kromoszomális aneuploiditás kimutatásának alapja az, hogy normál, diploid garnitúra esetén a két homológ szomatikus kromoszómának megfelelően két hibridizációs szignált kapunk sejtmagokként. Keresztreagáló próbáknál (5/19-es, 13/21-es, 14/22-es kromoszómák) a diszómiát 4 szignál jelzi, míg XY genotípus esetén a szexkromoszómák tekintetében 1-1 intranukleáris hibridizációs jel látható. Kevesebb vagy több jel az adott kromoszóma nyerését vagy vesztését jelzi, mely a keresztreagáló próbák esetén a két kromoszóma vonatkozásában pontosan nem identifikálható (2a és b ábrák). Szerencsés körülmény, hogy a szignálszám a sejtciklusban elfoglalt pozíciótól nem függ; az áramlási citometriásan szortírozott Go-Gi,S, valamint G2 fázisban lévő sejtek (peri)centromer régióra specifikus jeleinek száma azonos, mely _ 'n' monomer__ IIII -i0bp E1 E2 E1 E2 E1 E2 ------1----2------------------1_2-----------------1----2_... *T*T*3 ” n-T n * 1 *2^3 *“ n * 1 * 2 ..........1. Cx=Magasabb rendű ismétlődő egység (Higher-order repeat unit - HORU) 1. ábra: A kromoszómaspecifikus alfa szatellita DNS hierarchikus szerveződése. Az E1 és E2 hipotetikus restrikciós endonukleázok, melyek a magasabb rendű repetitív egységen belül egyszer hasítanak (60) 2940