Hidrológiai Közlöny 2009 (89. évfolyam)

6. szám - L. Hidrológiai Napok: "A hazai hidrobiológia ötven éve" Tihany, 2008. október 1-3.

átmérőjű membránfilteren szűrtük át, a biomasszát a filte­rekről centrifuga csövekbe mostuk, majd 3200 rpm-en 10 percig centrifugáltuk. A felülúszót elöntöttük, majd a végtérfogatot a kinyert üledék mennyiségének függvényé­ben 1,5-2 ml-re állítottuk be. A 2006. novemberi mintákat a csekély szeszton mennyiség miatt összeöntöttük, így a to­vábbiakban kompozit mintával (BTK) dolgoztunk. Közösségi DNS-izolálás és PCR A 16S rDNS bázissorrend elemzésre alapozott faji­ szintű azonosításhoz a baktériumok DNS-ét MOBIO Ultra Clean Soil Kit segítségével nyertük ki. A 16S rDNS szakaszokat 271 és 14921 univerzális eubakteriális primerekkel hot-start PCR során felszaporítottuk (kezdeti denaturáció 98°C 5 min, Taq polimeráz bemérés 84°C, 32 cikluson át denaturá­ció 94°C 30 sec, anelláció 52°C 30 sec, extenzió 72°C 1 min, végső extenzió 72°C 30 min). A PCR termékeket Vi­ogene PCR-M Clean Up kit segítségével tisztítottuk meg. Az izolált és a felszaporított DNS jelenlétét UV fény alatt 1 %-os agaróz gélben detektálták. Denaturáló grádiens gél elektroforézis (DGGE) A 2007-ben az egy időben végzett mintavételek során gyűjtött kútvizekből származó baktérium-közösségek sze­zonális változásait DGGE-vel vizsgáltuk. A tisztított PCR termékekre nested PCR-t állítottunk össze GC-toldalékos 3381 primer és 5191 primer felhasználásával (kezdeti dena­turáció 96°C 3 min, 32 cikluson át denaturáció 94°C 30 sec, anelláció 52°C 30 sec, extenzió 72°C 30 sec, végső exten­zió 72°C 10 min). Az amplikonokat 40-60%-os denaturáló gradiensű 8 %-os poliakril-amid gélben futtatók 100 V fe­szültségen 14 órán keresztül. A DGGE segítségével a kö­zösségi mintákban a baktérium taxonokra jellemző 16S rDNS szakaszokat szétválasztottuk egymástól, ezáltal az a­dott mikróba-közösségekre jellemző sávmintázatot kaptunk. Az elektroforézis leteltével a gélben lévő PCR-termékeket etídium-bromiddal festettük, majd a DGGE sávmintázatot UV fény alatt detektáltuk. A DGGE sávmintázatokat Total-Lab(TL 120) v 2006 gélkép-elemző szoftverrel értékeltük k. Klónkönyvtár készítése, reprezentáns klónok taxonó­miai azonosítása A baktérium-közösségek összetételének és a relatív do­minanciaviszonyok meghatározásához PROMEGA­­GEM­T Easy Vector kit segítségével molekuláris klónkönyvtárat készítettünk. Ligálás, majd Escherichia coli JM109 sejtek­be történő transzformálás után a sejteket ampicillin tartalmú LB-agarra szélesztettünk. A tenyésztés során csak az ampi­cillin rezisztenciát tartalmazó klónozó vektorral transzfor­mált sejtek képeztek telepeket, melyek mindegyike egy-egy környezeti 16S rDNS-klónt tartalmazott. A tenyészetekből a környezeti 16S rDNS szakaszokat M13 vektor specifikus PCR­ során tovább sokszorosítottuk. A PCR-t M131 és M13r primerpárral végeztük (kezdeti denaturáció 96°C 3 min, 32 cikluson át denaturáció 94°C 30 sec, anelláció 52°C 30 sec, extenzió 72°C 1 min, végső extenzió 72°C 10 min). Az így felszaporított klónokat restrikciós enzi­mekkel (HinóI és BsuRI, ill. HinóI és Alul) emésztettük. A hasított termékeket 2 %-os agaróz gélben futtattuk 80 V feszültségen 70 percig, majd a hasítási mintázato­kat UV fény alatt detektáltuk. A klónokat a hasítási mintázatuk alapján csoportosítot­tuk, majd a csoportreprezentáns klónok bázissorendjének meghatározását 5191 primer felhasználásával a jelölt ter­minátorú ciklikus szekvenálás módszerével végeztük, és ABI PRISM 310 Genetic Analyser segítségével elemez­tük. A klónok szekvencia-alapú azonosítását a BLAST internetes adatbázis felhasználásával végeztük. Eredmények és értékelésük A három kút (BT1, BT2, HT) 2007. áprilisi, júniusi és augusztusi mintáiból származó baktérium-közösségek DG­GE mintázataiból - az elektroforetikus csíkok számának, helyzetének, valamint intenzitásának függvényében - ösz­szehasonlító dendrogramot szerkesztettünk (1. ábra). Az ábrán az elektroforetikus csíkok egy-egy mintának feleltet­hetők meg, a sávok az egyes közösségekhez tartozó fajokat képviselik, a sávok intenzitása pedig az egyes fajok relatív abundanciáját mutatja. A gélfotón látható, hogy a BT1 és a BT2 minták baktériumközösségeit reprezentáló csíkok fő sávjaikban megegyeznek, ami a baktériumközösségek ha­sonló domináns fajösszetételét jelzi, azonban az egyes fajok relatív abundanciáját szezonális változások jellemzik. megfigyelhető, hogy a legjelentősebb eltérések a termálkút elektroforetikus sávmintázatai (HT) és a langyosvizű büdös­tapolcai mintázatok (BT) között figyelhetők meg. Ez a kü­lönbözőség a vízbázisok földrajzi távolságából, és az eltérő fizikai-kémiai jellemzőkből (kutak mélysége, vízhőmérsék- 1. ábra. A harkányfürdői gyógykutak vizéből származó baktériumközösségek DGGE mintázatainak gélképe és összahasonlító dendrogramja A legnagyobb hasonlóságot a BT2, valamint a BT1 júniu­si és augusztusi közösségek sávmintázatai mutatták közel 65 %-os, illetve 60 %-os hasonlósággal. Az áprilisi BT1 és BT2 mintázatok viszont nagymértékben eltértek ugyanazon kutak kora és késő nyári sávmintázataitól. A dendrogramon 1111 I I 1 T 1 I­I.' 1 ^­0­ HT aug. HT jún. HT ápr BT2 aug. BT2 jún. BT1 aug. BT1 jún. BT2 ápr BT1 ápr. r 0.30 —r~ 0.40 —r~ 0.50 —r~ 0 00 0.70 —r~ 0.80 —r~ 0.00 1—"H 1.00 ,

Next