Magyar Nőorvosok Lapja, 2000 (63. évfolyam, 1-6. szám)
2000 / 2. szám - BAKTERIOLÓGIA - Dósa Erika - Urbán Edit - Földes Márta - Török László - Kalmár László - Nagy Erzsébet: Az Affirm VPIII DNA hibridizációs teszt alkalmazása a női urogenitális traktus kórokozóinak vizsgálatában
pedés, koraszülés, chorioamnonitis, szülést követő endometritis létrehozásában is [3]. A második leggyakrabban előforduló kórokozó a sarjadzó gombák különböző speciesei, amelyek a felnőtt nők 75%-nál életük során legalább egyszer, 20%-nál legalább kétszer és közel 5%-nál még gyakrabban visszatérve a hüvelygyulladást okozzák. A Trichomonas vaginalis a harmadik leggyakoribb, de nem elhanyagolható szerepet játszó szexuálisan átvihető kórokozó, amely a világon évente 180 millió ember fertőzését hozta létre [2,4]. A hagyományos tenyésztési eljárásokkal a Trichomonas vaginalis-га tenyésztés esetén mintegy 24, az aerob baktériumok és sarjadzó gombák esetében 24-48 óra után kapunk eredményt. A bakteriális vaginózis diagnózis felállításához a jellemző klinikai tüneteket kiegészítő mikroszkópos vizsgálat mellett az anaerob tenyésztés 5 napot vesz igénybe [5-8]. A DNS hibridizációs technika közvetlenül a hüvelyváladék tamponos mintájából a fenti kórokozók egy órán belüli kimutatására alkalmas. Anyag és módszer Mintavétel és beküldés A vizsgálati anyagminták vételére a SZOTE Bőrklinika LTD, a Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika és az Urológiai Klinika Ambulanciáin került sor. A válogatott beteganyag lehetővé tette, hogy viszonylag magas pozitivitást találjunk vizsgálataink során. A válogatás kritériumai a következők voltak: 1. Először jelentkező beteg esetében a tipikus vaginitis tünetei mellett a hüvely pH extrém mértékű eltérése a normál hüvely pH 3,5^4 értékétől, KOH teszt pozitivitás. 2. Visszatérő beteg esetében: a korábbi tenyésztés eredménye ne legyen aerob baktérium, vagy a teszt által kimutatható kórokozók esetében az alkalmazott terápia ellenére nem következett be gyógyulás/javulás. Ha nem volt tenyésztés, abban az esetben, ha az empirikusan választott szerre nem következett be gyógyulás ill. javulás. A klinikusok vaginitis/vaginózis 196 tipikus klinikai tünetei esetén a hüvely hátsó boltozatáról vettek mintát. Gram festéshez minden esetben kenet készült. Az Affirm VPIII hibridizációs próbához a Becton Dickinson által a teszthez mellékelt mintavevő+transzport táptalaj tartozik. Az aerob+anaerob, gomba és mycoplasma-ureaplasma irányú tenyésztésre, valamint trichomonas vizsgálatra egy-egy külön tamponnal történt a mintavétel. A vizsgálati anyagok speciális transzport közegbe kerültek a laboratóriumba beszállításra. Az aerob-anaerob tenyésztésre Stuart-szemiszolid transzport közeget alkalmaztunk. A mycoplasma-ureaplasma tenyésztésre a Mycoplasma duo kit tartozéka egy speciális transzport táptalaj, amelyet kereskedelmi forgalomból szereztünk be. A Trichomonas vaginalis irányú tenyésztés céljára a CPLM (cystein, pepton, river, maltóz) szemiszolid táptalajban történt a mintavétel, amely egyúttal alkalmas a további tenyésztésre is. Laboratóriumi feldolgozás Törekedtünk a vizsgálati minták, a mintavételt követő a legrövidebb időn belüli (1-2 óra) feldolgozására, bár az Affirm teszthez tartozó transzport közegben +4°C-on 24 óráig is alkalmas még a minta a feldolgozásra. A klinikus által készítetett kenetet Gram szerint megfestettük, fénymikroszkóppal IOOOx nagyítással vizsgáltuk. A Stuart transzport közegben lévő hüvelyváladékot aerob tenyésztésre 5% marhavér, tartalmú agarlemez, főtt véres csokoládé, Eosin-metilénkék és Sabouraud agar lemez felületére oltották. A vértartalmú agrárlemezeket 48 órán át 5% CO2-ot tartalmazó termosztátban, az Eosin-metilénkék, Sabouraud agar lemezeket meleg szobában 37 °C-on inkubáltuk. A Sabouraud agarlemezeket az első 48 órai értékelést követően szobahőmérsékleten további 3 napig (összesen 5 napig) inkubáltuk. A 24 óra után megjelenő kórokozókat azonosítottuk, antibiotikum érzékenységüket meghatároztuk. A 24 óra után negatív lemezeket tovább inkubáltuk, végleges eredményt 48 óra után adtunk. Az anaerob tenyésztés céljából a mintákat anaerob véres agarlemezre, a Gardnerella vaginalis tenyésztésére 5% embervér (bármilyen vércsoportú, többnyire humán felhasználásra már nem alkalmas vörösvértest massza) tartalmú agarlemezre oltottuk és 5 napon át anaerob kamrában inkubáltuk. Az anaerobnak bizonyuló baktériumokat azonosítottuk. A mycoplasma-ureaplasma irányú vizsgálatokat a Mycoplasma duó(Sanofi Diagnostics Pasteur) kereskedelmi forgalomból beszerezhető kittel végeztük. 24—48 óra után szabad szemmel leolvastuk a színváltozáson alapuló, M. hominis és U. urealyticum jelenlétére vonatkozó eredményt. A Trichomonas vaginalis irányú vizsgálat tenyésztési eljárással, CPLM szemiszolid táptalajban történt. Először , majd 18-24 óra után 400x nagyítással fénymikroszkópos vizsgálattal a jellegzetesen mozgó Trichomonas vaginalis alakokat vizsgálták. DNS hibridizációs technika Az Affirm VPIII (Becton Dickinson) DNA hibridizációs teszttel végzett meghatározás 3 részből áll: 1. A minta előkezelése során a kettős DNS szál lízis pufferrel és 85 °C hőkezeléssel történő szétválasztása, majd puffer oldattal történő stabilizálása történik meg (10 perc). 2. Hibridizáció: А РАС (Probe Analysis Card) pozitív, negatív kontrollok mellett a Gardnerella vaginalis, a Candida speciesek és a Trichomonas vaginalis egyszálú DNS-ével fedett golyócskákat tartalmazza, amelyek a vizsgálati anyagból az előkezelés során feltehetően jelenlévő szintén egyszálú DNS-sel történő hibridizációra nyújt lehetőséget. (1. ábra) A hibridizácó a 7 részből álló reagens kazettából játszódik le, amelybe a РАС lapocskát a készülék a programozásnak megfele- Magyar Nőorvosok Lapja 63 (2) 2000.